本实验采用衰减全反射傅立叶变换红外光谱法结合聚类分析方法定性鉴别花椒属生药材。结果显示，该方法可以有效地鉴别不同产地的花椒药材，且与经典形态分类学结果基本一致，是一种快速、简便、低耗的新型分析技术。
花椒为芸香科植物花椒(Zanthoxylum bungesnum Maxim．)的干燥成熟果皮，具有祛风散寒、活血舒筋、镇痛等功效。一直以来，傅立叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectrometry，FTIR)是纯化合物结构鉴定的有力工具之一。近年随着FTIR方法本身，如衰减全反射(attenuated total reflectance，ATR)技术以及化学计量学的快速发展，它在复杂物质如细胞、中药材等分析领域也有研究应用。本实验以不同产地的7种花椒属11个中药材样品为研究对象，考察了ATR-FTIR实验的影响因素，同时利用聚类分析法鉴别了不同产地的花椒药材，并与传统的生药形态学鉴别以及HPLC测定结果进行了初步的比较。
1 材料和方法
1．1 样品、试剂和仪器 l1个花椒属样品由陶朝阳采集，由本院生药学教研室陈万生副教授鉴定，其编号及采集地点分别为：1～5，刺异叶花椒(z．dimorphophyllum)，湖北鹤峰、湖北兴山、陕西平利、陕西略阳、四川莱蒙；6，壳花椒(Z．dissitum)，陕西平利；7，异叶花椒(Z．ovalifolium)，陕西平利；8，刺花椒(Z．acanthopodium)，湖南龙山；9，狭叶花椒(Z．stenophyllum)，贵州花溪；10，花椒(Z．bungeanum)，贵州毕节；11，竹叶花椒(Z．armature)，贵州毕节。VECTOR 22傅立叶变换红外光谱仪，ATR 附件及OPUS分析软件(德国Bruker公司)；HPLC 分析仪515泵、2487检测器(美国Waters公司)；YWG C18色谱柱10μm，250mm ×4.5 mm(大连依利特公司)。6-(3’-甲基-2’，3'-丁二醇基)-7-乙酰氧基香豆素(sub1)，6-(3’-甲基-2’，3'-丁二醇基)-7-羟基香豆素(Sub2) 由花椒中提纯，分析纯甲醇，重蒸水
1．2 红外光谱分析 药材经60℃烘干6h，粉碎，过80目筛，取约50mg粉末置于硒化锌体表面，测定其ATR谱，扫
描范围4000～600/cm，分辨率4/cm，扫描次数64次。重复测定5次，求平均光谱，所得光谱求一阶导数光谱。光谱聚类分析采用矢量归一化法预处理，以类平均距离为聚类依据。
1．3 HPLC 分析药材经60℃ 烘干6h，粉碎，过80目筛，取粉末100mg，加入10m1甲醇超声20min，2000r／min离心5min，0.45μm微孔滤膜过滤，重复3次，合并提取液，减压浓缩，定容至50.0ml待测。精密配制sub1、sub2，质量浓度为：0.208、0.160 mg／ml，分别稀释成不同浓度，按下述色谱条件测定：流动相为甲醇-水(40：60，V/V )，流速：0.5ml／min，进样量10μ1，灵敏度0.5 AUFS，检测波长334nm。
2 结 果
2．1 影响实验的因素
2.1．1 粒度大小 取经60℃干燥的样品，粉碎，分别过28、40、80、100目筛，取约50mg样品在上述光谱条件下测定。结果显示，小于60目筛的样品光谱重现性较差；80、100目样品光谱的重现性均较好，本实验取过80目筛的样品进行测定。
2．1．2 分辨率 取上述样品约50mg，分辨率分别设置为2、4、8、16、32、64 /cm时进行测定。分辨率为2/cm时，光谱信息丰富，但噪音的影响也最大；分辨率大于8/cm时，部分样品信息损失。本实验采用分辨率为4/cm。
2．1．3 扫描次数 扫描次数分别设置为8、16、32、64、128次进行测定，结果表明，扫描次数越多，噪音影响越小，但扫描时间越长。本实验设扫描次数为64次。
2．1．4 谱区范围 扫描波长范围为4000～600/cm，通过全谱区光谱扫描发现，1850～700/cm范围的信息量最丰富，本实验取此谱区进行聚类分析。
2．2 ATR-FTIR 和一阶导数光谱 从ATR光谱及一阶导数光谱图中可以看到一些细微的差异，但总体而言其光谱相似程度很大，很难从峰位加以鉴别，其原因主要是中药有效成分虽有不同，但由于它们在中药成分中所占比重较少，含量低，信号弱，因此它们的吸收峰常常被掩盖。
2．3 聚类分析 由图2可见，1～ 5、7样品先聚为一类(除7样品以外都同属刺异叶花椒属)，再与6、8～11样品聚类，经形态学分类7样品为异叶花椒，与刺异叶花椒比较相近，聚类分析结果与经典形态分类一致。
2．4 HPLC测定结果 5个刺异叶花椒样品中sub1和sub2含量较高(除3号样品外，含量均>0.008 g／kg)，而其他6种相对较低(均< 0.006k／kg)。聚类分析结果与样品中sub1、sub2含量存在一定的相关性，提示红外光谱分析与生药中活性成分含量存在相关。
3 讨论
常规的花椒药材质量控制包括鉴别及有效成分含量测定等，前者基本采用显微鉴别、薄层色谱法等传统方法；而后者一般采用HPLC法。随着中药现代化的进程，需要从中药源头上进行药材种质资源及品系道地性的考察等研究，薄层色谱法和HPLC法均要求对样品做前处理，大量消耗有毒有机试剂，耗时费力，操作复杂且污染环境，在系统性、特征性、稳定性等方面存在一些问题，需要改进才可能适应上述的要求；ATR-FTIR法用于生药鉴别的结果准确与否只取决于制样的标准化及光谱的信息处理技术，红外光谱分析其稳定、快速、低耗、无损的检测方法将优于传统的检测方法，ATR-FTIR 技术在生药鉴别这一领域具有很大的研究意义和实际应用价值
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